Vykdydami genetinius tyrimus dažnai susiduriame su nepakankamais RNR mėginiais, pavyzdžiui, tiriant mažyčius anatominius burnos navikus, net vienos ląstelės mėginius ir specifinių genų mutacijų, kurios žmogaus ląstelėse transkribuojamos labai žemu lygiu, pavyzdžius.Žinoma, COVID-19 tyrimui, jei tepinėliai bus ne tinkamoje vietoje arba per mėginių ėmimą nebus pakankamai kartų, imties dydis bus labai mažas, todėl Sveikatos ir šeimos planavimo komisija pasirodė prieš dvi dienas ir išlaikė testą, o jei nukleorūgščių mėginių ėmiklis nepaėmė šešių mėginių, galite apie tai pranešti.
Reagento jautrumas yra svarbus, nes turime tokią ar kitą problemą, tad ką galime padaryti, kad pagerintume RT-PGR jautrumą?
Prieš aptardami galimus sprendimus, paminėkime dvi dideles situacijos, kurią ką tik paminėjome, komplikacijas.
Visų pirma, mes nerimaujame dėl RNR praradimo, kai mūsų mėginyje yra tik kelios ląstelių populiacijos.Jei naudojami tradiciniai atskyrimo ir valymo metodai, pvz., kolonėlės metodas arba nukleorūgščių nusodinimo metodas, yra didelė tikimybė, kad keli mėginiai bus prarasti.Vienas iš sprendimų yra pridėti nešiklio molekulę, pvz., tRNR, tačiau net ir tada nėra garantijos, kad mūsų atkūrimo eksperimentas bus tinkamas.
Taigi koks yra geresnis būdas?Geras pasirinkimas kultivuotoms ląstelėms arba mikroanatominiams mėginiams yra tiesioginis lizės metodas.
Idėja yra padalinti ląsteles 5 minutes, išleisti RNR į tirpalą, tada sustabdyti reakciją 2 minutėms, tada pridėti lizatą tiesiai į atvirkštinės transkripcijos reakciją, kad RNR nebūtų prarasta, ir galiausiai tiesiogiai įdėti gautą cDNR. į reakciją realiuoju laiku.
Bet ką daryti, jei dėl riboto pradinio taško arba nedidelio tikslinio geno ekspresijos kiekio galime perdirbti visą RNR ir vis tiek nepateiksime pakankamai šablonų, kad gautume gerą signalą realiuoju laiku?
Tokiu atveju išankstinis stiprinimo žingsnis gali būti labai naudingas.
Toliau pateikta schema, kaip padidinti jautrumą po atvirkštinės transkripcijos.Prieš pradėdami, turime paklausti, kurie taikiniai mus domina, kad sukurtume konkrečius pradmenis šiems tikslams išankstiniam sustiprinimui.
Tai galima pasiekti sukuriant mišrų gruntą su iki 100 porų gruntų ir reakcijos ciklą nuo 10 iki 14 kartų.Todėl norint iš anksto amplifikuoti gautą cDNR, reikia specialiai šiam reikalavimui sukurto pagrindinio mišinio.
Priežastis, kodėl nustatytas ciklų skaičius nuo 10 iki 14, yra ta, kad šis ribotas ciklų skaičius užtikrina atsitiktinumą tarp įvairių taikinių, o tai labai svarbu tyrėjams, kuriems reikia kiekybinės molekulinės informacijos.
Po išankstinio amplifikacijos galime gauti didelį cDNR kiekį, kad aptikimo jautrumas galinėje dalyje labai pagerėtų, o mes netgi galime praskiesti mėginį ir atlikti kelias realaus laiko PGR reakcijas, kad pašalintume galimas atsitiktines klaidas.
Paskelbimo laikas: 2023-04-11